文章题目：Galectin Trafficking Pathway-Enabled Color-Switchable Detection of Lysosomal Membrane Permeabilization

发表期刊 : Analytical Chemistry

影响因子 : 8.008（2021）

通讯单位 : 厦门大学

        溶酶体是膜结合的酸性细胞器，溶酶体膜通透性（LMP）会导致溶酶体酸性丧失，将溶酶体水解酶释放到细胞质中，这是一个已知的触发细胞死亡的过程。LMP与多种人类疾病有关，如肾损伤，炎症等。此外，研究人员开发了通过诱导肿瘤细胞LMP的方法用于肿瘤治疗。因此，LMP的光学成像对于研究LMP相关疾病和肿瘤治疗的发展具有重要意义。

        由于嗜酸性探针会从pH升高的溶酶体和LMP⁺溶酶体中消散，因此常用的商业化溶酶体探针无法跟踪LMP。目前，LMP通常使用荧光标记的葡聚糖（FITC-葡聚糖）进行检测，但这种方法仍然受到LMP信号损失的限制。作为对上述方法的补充，作者利用了半乳糖凝集素转运途径，其特点是胞质中的半乳糖凝集素在LMP发生时从细胞质转移到溶酶体，与溶酶体内膜糖蛋白上的β-半乳糖苷结合。通过该途径的辅助，作者开发了一种通过颜色切换成像区分正常溶酶体及LMP溶酶体的方法，对于探索LMP在生物学和疾病中的作用很有价值（图1）。

图1 半乳糖凝集素途径辅助的颜色切换LMP检测示意图。（A）细胞质半乳糖凝集素向LMP⁺溶酶体的易位以及半乳糖凝集素与溶酶体膜糖蛋白的结合。（B）商用FITC-葡聚糖，用于LMP⁺溶酶体探针泄漏引起的LMP信号丢失检测。（C）^DmLac-Green和^DmSia-Red的LMP双色成像。^DmLac-Green与重新定位到LMP⁺溶酶体中的半乳糖凝集素的结合导致绿色荧光的捕获和产生，而^DmSia-Red泄漏到细胞质中导致红色荧光的丢失。

        作者首先设计并合成了^DmSia-Red和^DmLac-Green两探针(图2)，分别具有常亮红色荧光和酸敏感绿色荧光。^DmLac-Green另一端连接六个相同的乳糖单元，使其能够以更高的亲和力结合半乳糖凝集素。^DmSia-Red另一端连接六个相同的唾液酸单元，使其能很好地保留在唾液酸中并在LMP发生后作为^DmLac-Green的颜色补充，达到双色成像的效果。

图2 DmSia-Red和DmLac-Green的pH响应性。（A）DmSia-Red和DmLac-Green的化学结构。（B）在pH 4.0-8.5的缓冲液中，DmSia-Red（10 μM）和DmLac-Green（10 μM）的荧光发射。

        首先作者分别验证了两探针单独在细胞中的定位及成像结果。结果显示，处理溶酶体pH升高后（图3A，图3B），发现两探针均能很好地保留在溶酶体内并呈荧光开启状态。处理溶酶体LMP后（图3C，图3D），^DmSia-Red不能与半乳糖凝集素结合而从溶酶体中漏出，荧光消失。^DmLac-Green与半乳糖凝集素结合保留在LMP溶酶体，呈绿色荧光。

图3 DmSia-Red和DmLac-Green对溶酶体的选择性以及探针在pH升高及LMP溶酶体中的保留。（A）DmSia-Red在pH升高的溶酶体中的保留和成像。（B）DmLac-Green在pH升高的溶酶体中的保留和成像。（C）DmSia-Red在LMP溶酶体中的保留和成像。（B）DmLac-Green在LMP溶酶体中的保留和成像。

        根据两探针单独成像结果，作者将两探针联合使用进行应激溶酶体状态区分（图4）。结果表明，当溶酶体功能正常时，溶酶体呈单一红色荧光。当溶酶体pH升高后呈现红绿双色，而在LMP发生后切换至绿色荧光信号。验证了该方法对识别LMP溶酶体的适用性。并且，作者将该方法与商用FITC-葡聚糖进行对比试验，结果显示此方法具有更高的检测灵敏度。

图4 DmSia-Red和DmLac-Green联合使用对不同状态溶酶体进行区分成像。

        接着，作者利用该探针对ROS造成的溶酶体LMP及细胞死亡过程中的LMP进行了检测。结果表明，该方法可以对不同ROS浓度造成的LMP程度进行区分和成像（图5），并能够检测出不同死亡方式中溶酶体的LMP程度（图6），为：铁死亡>坏死>凋亡。这些数据表明，LMP双色检测方法可以灵敏地区分细胞内溶酶体的不同状态，为研究LMP相关的细胞应激和疾病提供了有价值的工具。

图5 ROS诱导的不同程度的LMP检测。

图6 DmSia-Red和DmLac-Green识别不同细胞死亡途径中的LMP程度。

原文链接：

https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/acs.analchem.1c02387

作者：凡飞

审核：李全才，吕友晶

编辑：邵萌

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