文章题目：Cellular glycan modification by B3GAT1 broadly restricts influenza virus infection

发表期刊：Nature Communications

影响因子：17.694（2022）

通讯单位：Duke University School of Medicine

        呼吸道病毒感染是公共卫生的主要负担，气雾性传播促进了甲型流感病毒(IAV)和冠状病毒的全球大流行，虽然接种疫苗通常被认为是预防这类感染的最佳战略，但许多已知的病毒株仍然缺乏有效的接种方法，因此，广谱抗病毒预防和治疗策略对感染的前线防御具有重要意义。为了寻找新的、可能作用更广的、对人类病毒株具有活性的限制因子，文章选择对一株B型流感病毒(IBV)进行筛查。利用IBV B/ Yamagata/ 16/ 1988(YAM/88)株，CRISPR激活筛查证实宿主糖基转移酶β-1,3-葡萄糖醛酸基转移酶1(B3GAT1)是一个病毒限制因子。随后的机制研究表明，B3GAT1可能通过竞争宿主细胞唾液酸转移酶来阻止病毒唾液酸受体的细胞表面表达，从而阻止病毒受体的结合。 

图1 全基因组CRISPR激活屏幕识别B型流感病毒的限制因素

        实验通过反复感染会引起大量基因的内部竞争的原理，最终仅留下由少数具有最强抗病毒活性的基因种群（图1a）。正如预期的那样，检测到的sgRNAs的数量在每一轮感染中都有所下降，少数sgRNAs的计数变得越来越突出(图1b)。NXPE4、B3GAT1、B4GALNT2、TGM2、ANXA11和GPHA2是输出群体中排名最高的六个基因(图1b)，SgRNA转导对基因表达的上调是可变的，从没有影响到超过1000倍的诱导(图1d)。B4GALNT2的上调阻止了YAM/88的感染，但此外，B3GAT1和NXPE4也显著地抑制了病毒感染(图1e)。

图2 B3GAT1竞争唾液酸转移酶阻止细胞表面唾液酸表达

        文章通过RNA和蛋白质分析证实B3GAT1过表达(图2a，b)。接下来，用YAM/88PB1-mNeon感染细胞，并观察到在B3GAT1 A549细胞中的病毒感染被抑制 (图2c)。B3GAT1是一种糖基转移酶，作者观察到该蛋白的高尔基定位与其活性一致(图2d)。通过MALDI-TOF质谱分析mCherry和B3GAT1 A549两种细胞中的总N-糖链，发现虽然mCherry A549细胞中含有多种含有唾液酸的糖链，但其中大多在B3GAT1 A549细胞中未检出(图2e，f)。此外，B3GAT1 A549细胞中含有葡萄糖醛酸化(含GlcA)的糖链，而在mCherry A549细胞中没有检测到 (图2e，f)。这表明，YAM/88感染的抑制可能是由于GlcA取代了唾液酸病毒受体导致的。通过染色实验发现，B3GAT1的表达分别降低了细胞表面α2,3-和α2,6-唾液酸的表达，而能够识别末端GlcA作为HNK-1表位一部分的抗体未能对野生型A549细胞进行染色，但在B3GAT1过表达的情况下染色良好，甘露糖凝集素(GNL)对两种细胞系都进行了染色(图2g)。接下来，通过荧光标记法发现B3GAT1的过表达确实降低了YAM/88与细胞的结合能力(图2h，i)。因此作者推测，B3GAT1唯一地竞争宿主唾液酸转移酶，以防止细胞表面唾液酸的表达，从而排除IBV结合和随后的细胞进入的可能性(图2j)。

图3 B3GAT1广泛限制需要唾液酸才能进入细胞的病毒

        由于许多病毒都需要唾液酸才能进入宿主细胞，因此，作者假设B3GAT1将限制任何需要唾液酸进入的病毒。用多种流感病毒在mCherry和B3GAT1 A549细胞中进行了单周期感染，结果发现，B3GAT1的过表达显著减少了所有测试的流感病毒的感染，在表达B3GAT1的MDCK细胞中观察到两种病毒的复制动力学延迟和终点滴度降低(图3)。接下来，作者测试了不同的病毒是否会对B3GAT1的过度表达敏感，结果均符合B3GAT1广泛限制需要唾液酸才能进入细胞的病毒的假设。

图4 B3GAT1可以在体内安全表达，以防止致命的流感病毒感染

        B3GAT1可在体内安全表达，预防致命流感病毒感染。通过小鼠气管产生气液界面(ALI)培养的方式，将人B3GAT1基因转移到ALI细胞，观察到B3GAT1 RNA比GFP转导的ALI细胞增加了将近10000倍(图4a，b)。B3GAT1在这些AAV转导的ALI培养物中的过表达降低了IBV B/ Malaysia/ 2506/ 2004(MAL/04)(图4 c-e)和IAV strain A/Puerto Rico/8/1934 (PR8) (图4 f-h)的感染和生产滴度。接下来作者想确定是否可以利用以上策略来防止体内流感的发展。AAV6载体通过鼻腔接种将人源B3GAT1或GFP转移到雌性C57BL/6J小鼠中(图4i)。通过显微镜观察证实了这种方法能将基因转移到呼吸道上皮细胞的结论 (图4j)，并且B3GAT1的瞬时上调在体内具有很好的耐受性(图4k)。作者用Mal/04(一种鼠适应的IBV)感染小鼠，发现外源B3GAT1在呼吸道中的表达极大地改善了感染结果(图4l)。并且，转导B3GAT1的小鼠在感染其他病毒后亦只显示出轻微的体重下降，且存活率可达100% (图4m，n)，这说明B3GAT1具有较广泛的抗病毒活性。通过这些数据证明，B3GAT1上调不仅在体外有实用价值，而且在体内也是一种抗病毒策略。

总结：

        传染性呼吸道病毒感染具有流行性威胁，广谱的抗病毒战略可以对其进行改善。本文进行了B型流感病毒(IBV)全基因组CRISPR的激活筛查，发现一种β-1，3-葡萄糖醛酸基转移酶1(B3GAT1)可以阻止细胞表面唾液酸的表达，从而有效地阻止IBV的感染。通过在小鼠呼吸道上皮细胞中特异性表达B3GAT1，发现其过表达不仅具有良好的耐受性，而且还能保护雌性小鼠免受多种流感病毒的致命病毒攻击，包括H1N1 IAV。因此，B3GAT1可能是宿主定向的广谱抗病毒靶点，具有抗临床相关呼吸道病毒的作用。

原文链接：

https://www.nature.com/articles/s41467-022-34111-0

作者：王维雯

审核：李全才，吕友晶

编辑：邵萌

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