文章题目：Use of intercellular proximity labeling to quantify and decipher cell-cell interactions directed by diversified molecular pairs

发表期刊 : Sci. Adv.

影响因子 : 14.957（2022）

通讯单位 : 南京大学，Scripps研究所

        细胞间相互作用（CCI）是科学家长期关注的研究课题，通过揭示特定细胞之间的相互作用机制，有助于理解多种疾病的发生和发展，并为解决疾病问题提供新思路。相比传统的显微镜成像技术，化学生物学工具具有更大的优势，能够减少背景干扰和非特异性标记，并有望发展成为量化细胞间相互作用强度的标尺。Scripps研究所吴鹏教授2020年在Cell上发表了一篇题为Detecting Tumor Antigen-Specific T Cells via Interaction-Dependent Fucosyl-Biotinylation 的文章，首次提出了FucoID方法及其应用前景（图1），并进行了大量实验验证。该方法源于一个偶然的发现：岩藻糖供体自体连接岩藻糖转移酶（FT）复合物（GDP-Fuc-FT）能够快速而简单地在捕手细胞表面安装FT，使捕手细胞具备对邻近细胞进行糖标签标记的功能，并且该功能具有捕手细胞靶向性和功能特异性；此外，由于FT的酶活口袋具有包容性，能够识别并转移带有大标签的岩藻糖供体，因此外源标签供体糖GDP-Fuc-Bio也可以被利用。基于抗原特异性识别和化学酶法修饰，被捕手细胞打上Biotin标签的猎物细胞Prey Cell可以用于后续流式筛选富集、成像甚至进一步互作信号量化、细胞功能化。

图1  2020年，FucID技术的基本原理(Cell, 2020 Nov 12;183(4):1117-1133.e19.)

        最近，南京大学配位化学国家重点实验室李劼教授课题组在Sci. Adv.上发表了题为Use of intercellular proximity labeling to quantify and decipher cell-cell interactions directed by diversified molecular pairs的研究论文。本文延续了之前的FucID细胞临近标记基础理论，优化出更均一的GDP-Fuc-FT复合体工具；发展出抗体相关的糖基转移酶复合物探针Ab-sFT；丰富了介导的分子类型：PD-1/PD-L1，CAR-antigen等；也发展了新用途：发现和识别细胞互作类型、发现分子标签图鉴以及量化细胞互作强度（图2）。

图2  2022年，FucID技术的优化与应用扩展(Sci. Adv.,2022 Dec 21;8(51):eadd2337)

        在岩藻糖供体GDP-Fuc（GF）与FT偶联方面，本文采用了在FT上定点连接的策略。通过基因工程在FT的C端融合能被转肽酶SrtA识别的特定短肽，进行四嗪（Tz）click基团的定点引入，然后通过iEDDA点击化学反应定点连接GF。定点连接避免了批次差异性，更好地把控了GF-sFT的均一性（图3）。

图3 基于转肽酶的GF-sFT的构建

        该复合物对诱饵细胞进行组装的最适浓度在NK92细胞上进行了探究。外源游离的LacNAc可以终止反应（图4）。

图4 组装诱饵细胞的GF-sFT最适浓度在NK92细胞上进行探究

        通过岩藻糖转糖基反应制备诱饵细胞Cell-sFT后，首先在DC细胞和T细胞二者的互作中验证本方法学。将OVA_257-264处理过的DC-sFT细胞（OVA _257-264抗原将被提呈在MHC上）和OT-1 CD8+T细胞（来自OT-1 转基因小鼠，其CD8+T细胞的TCR受体能特异性识别OVA257-264肽段）共孵育2小时后，添加外源GDP-Fuc-Biotin糖供体。30分钟内，GDP-Fuc-Biotin被转移至能与OVA_257-264抗原特异DC-sFT相互作用的OT-1 CD8+T细胞表面的LacNAc受体上，即实现了邻近标记。而未经抗原处理和经不相关抗原（LCMV蛋白）处理的DC-sFT细胞，就没有将GDP-Fuc-Biotin转移至CD8+ T细胞表面的现象。且DC细胞上FT的安装不会影响其对T细胞 CD69的激活特性（图5）。这充分体现了DC-sFT工具是基于分子介导的、抗原特异的、生物正交的可靠标记工具。

图5 基于分子特异性的DC-T细胞互作：Cell-sFT方法学可行性确证

        除DC-T细胞互作外，作者还发展了基于其它分子介导的、利用其他细胞作为捕手的标记工具，甚至癌细胞也可以作为探针工具进行T细胞的临近标记和筛选，这里癌细胞充当了一个抗原提呈（抗原提呈细胞，Antigen Presenting Cells，APC）的角色（图6）。

图6 其他分子介导的FucID模型及流式验证结果

        为了探索 FucoID 是否可用于 CCI定量分析，作者构建了 CAR-Jurkat（CAR anti-HER2）和具有不同HER2表达水平SKOV3细胞的共同孵育模型来证明此概念（图7）。用流式细胞筛选确证量化的可能性后，又将HER2差异表达的SKOV3细胞混入人外周血单核细胞（PBMC）中（图8），来验证FucoID 在复杂系统中的特异性和选择性。

图7 在HER2差异表达的捕猎细胞上证明FucID可用于定量分析CCI

图8  FucoID在复杂系统中的特异性和选择性

        最后，作者通过抗体糖工程编辑构建了Ab-sFT（图9），适用于捕手细胞为难以分离纯化的原代细胞、难以实现基于细胞FT标记的情况。抗体会特异性地把能够与捕手细胞发生相互作用的猎物细胞打上biotin标记。该方法被用于临床膀胱肿瘤细胞样本中的能与高表达HER2癌细胞相互作用的T细胞筛选（图10）。

图9 利用抗体糖工程编辑技术构建Ab-sFT

图10 Ab-sFT在人膀胱癌临床细胞样本中筛选高表达HER2的肿瘤细胞

        综上所述，FucoID是一项将糖化学生物学应用于肿瘤生物学研究的经典案例。本文通过改进GF-sFT和开发Ab-sFT 偶联物，丰富了FucoID技术的工具箱。GF-sFT已被进一步用于构建不同的基于细胞的探针，而Ab-sFT让FucoID能够应用于复杂的生理环境。Ab-sFT实现了通过多色流式细胞术分析来直接表征临床样本中与 HER2+癌细胞相互作用的细胞，这为解析肿瘤特异性T细胞的分子特征提供了机会。另外，与体外药物筛选相比，探索对细胞间相互作用CCI影响的筛选，更能反映自然的生理环境，FucoID技术将会广泛应用于靶向药物筛选和作用机制研究中。

原文链接：

https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.add2337

作者：卢伟乔

审核：李全才，吕友晶

编辑：邵萌

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