文章标题：Fully synthetic Tn-based three-component cancer vaccine using covalently linked TLR4 ligand MPLA and iNKT cell agonist KRN-7000 as built-in adjuvant effectively protects mice from tumor development

发表期刊：Acta Pharmaceutica Sinica B

影响因子：14.903（2022）

通讯单位：广州中医药大学

        肿瘤疫苗接种是通过激活和增强免疫来治疗癌症的有效方法。肿瘤相关的糖类抗原（TACA）与肿瘤的转移和发展密切相关，可以作为肿瘤疫苗开发的一类靶点。但是单独TACA不能激活辅助性T细胞，T细胞的独立免疫原性较弱，没有足够的免疫应答。而解决这一缺点的一种有效方法是与免疫原性载体偶联制备复合物，来提高TACA特异性的免疫应答。该类复合物具有被免疫细胞识别和呈递的特点以及均一性好、结构明确的特点，有利于进一步的构效关系以及结构优化的研究。基于以上研究背景，作者设计了一种以Toll样受体（TLR4）配体MPLA和不变自然杀伤性T（iNKT）细胞激动剂KRN-7000为内置佐剂基于Tn抗原的三组分共价肿瘤疫苗。通过设置两种内置佐剂联合作用，更好的发挥免疫抗肿瘤作用。

图1设计的疫苗结构

        为了避免对MPLA和KRN7000活性的影响，作者设计了MPLA的1-O位和KRN7000的6-N位作为偶联位点，以1, 2, 3-三氮唑和双官能团酰基作为连接物用于构建MPLA-Tn-KRN7000（图1 A）。除此之外，作者还设计了相应的双组分疫苗Tn-MPLA、Tn-KRN7000和半合成糖蛋白Tn-CRM197(图1 B-D)作为对照，系统地评价和比较了结合疫苗和Tn-MPLA与Tn-KRN7000的物理混合物的免疫和抗肿瘤效果。

图2 MPLA-Tn-KRN7000的逆合成分析

        作者设计的三组分偶联物MPLA-Tn-KRN7000的逆合成分析如图2所示。首先通过拆解1, 2, 3-三氮唑基得到了MPLA片段（1）和Tn-KRN7000片段（2）。MPLA片段被拆分为脂肪链（3）和异头位带有叠氮乙基的关键二糖（4）。Tn-KRN7000片段被拆解为带有丙炔基和氨基的Tn衍生物（5）和带有游离羧基的KRN7000衍生物（6）。所有这些片段都可以从市场上可以获得的原料中获得。

图3 MPLA-Tn-KRN7000的合成

图4 二组分偶联物和糖蛋白偶联物的合成

        基于逆合成分析，对三组分MPLA-Tn-KRN7000的合成需要先获得片段4、片段5和片段6，图3 A-C给出了各片段的合成路线、反应条件和产率。在合成过程中，保护基团对偶联反应起着至关重要的作用。Tn上的羟基和KRN7000上的脂质采用乙酰基和TBS基团保护，在反应中根据需要可以选择性地脱除。MPLA和KRN7000的碳水化合物环上的羟基使用苄基保护，该保护基团可以在最终组装后同时被去除。有了各片段后按照图3 D中合成路线完成各片段的组装，最终成功完成三组分的共价疫苗MPLA-Tn-KRN7000的构建。合成过程中糖苷化反应、酰胺化反应、酯化反应以及点击化学反应被广泛应用。选取适当的中间产物及反应类型完成了对二组分和半合成糖蛋白偶联物的构建如图4所示。其中，铜催化的点击化学反应因其底物结构简单，反应速率高而广泛应用于连接物和化合物的偶联。但是考虑到生成的1, 2, 3-三氮唑对半合成糖蛋白偶联物免疫活性的影响，在Tn-CRM197的合成中更换了反应性高而且对免疫原性影响很小的32作为柔性连接物。

图5 合成偶联物在野生型小鼠中的免疫学研究

        接下来，作者对合成偶联物的免疫学进行研究。为了提高偶联物的溶解性和免疫原性，作者采用超声分散法将偶联物：胆固醇：1, 2-二硬脂酰甘油-3-磷酸胆碱以10: 50: 65摩尔比的比例混合制备形成脂质体。由于糖蛋白疫苗与外佐剂联合免疫更有效，因此用Tn-CRM197和临床使用的铝佐剂在PBS缓冲液（pH = 9.6）中充分混合制备形成乳剂。作者首先以野生型C57BL/6小鼠为实验对象，探究了不同偶联物制剂诱导抗血清中Tn特异性抗体滴度的评价。通过最有效浓度的测定，确定每0.1 mL脂质体6 mg的Tn剂量为最有效浓度。IgM和IgG分别表示最初免疫应答和长期二次免疫，根据抗体滴度分析，IgM在21天达到高峰而IgG在38天滴度最高，说明两种免疫反应均被触发。在抗体亚型滴度测定中发现了高滴度的kappa和IgG抗体，这表明全合成共价偶联物都能诱导出强大的Tn特异性和T细胞依赖性的免疫反应。而且发现Tn-MPLA和Tn-KRN7000的混合联用效果远低于MPLA-Tn-KRN7000，说明共价连接的MPLA和KRN7000作为免疫刺激剂，可以协同激活TLR4和iNKT细胞信号通路，比单独使用更有效地提高抗Tn免疫应答。

图6 合成偶联物在TLR4基因敲除小鼠中的免疫学研究

图7 合成偶联物与CD1d-His蛋白的结合亲和力研究

        为了确定MPLA-Tn-KRN7000的激活TLT4和iNKT细胞的协同作用，作者进一步进行验证。对TLR4通路的验证选用了TLR4基因敲除小鼠抗血清中Tn特异性抗体滴度与野生型的变化来分析，结果如图6所示Tn-MPLA和MPLA-Tn-KRN7000组抗体滴度明显降低，而Tn-KRN7000组变化不大。在抗体亚型的滴度分析中，各亚型也是出现了相同的变化，说明Tn-MPLA和MPLA-Tn-KRN7000可以通过激活TLR4来提高Tn特异性免疫应答的。CD1d是一种与调控NKT细胞激活的抗原呈递蛋白。通过检测与CD1d的结合能力来判断疫苗激活iNKT细胞通路的情况。在这里作者选用了鼠源和人源的两种CD1D蛋白进行分析，结果如图7所示，对照和Tn-mpla与该蛋白几乎没有结合，Tn-KRN7000有强结和且高与MPLA-Tn-KRN7000组的结合能力，这也验证了在TLR4敲除小鼠中，Tn-KRN7000组抗体滴度高与三价疫苗的结果。两个实验共同验证了共价连接的MPLA-KRN7000免疫刺激剂能协同激活TLR4和iNKT细胞，提高Tn的免疫原性。

图8 合成偶联物诱导的抗血清中细胞因子的浓度分析

        为了研究合成的偶联物是否能诱导细胞因子的产生，作者对聚集的抗血清中γ干扰素（IFN-γ）和白细胞介素4 （IL-4）的水平进行了评估。IFN-γ的高诱导提示Th1细胞活化，可诱导巨噬细胞活化和IgG抗体转化。IL-4的大量产生促进了Th2细胞的激活，有助于增强B细胞免疫和IgG1抗体的形成。结果如图8所示，所有全合成的偶联物都诱导Th1/Th2混合免疫反应，且以细胞免疫反应为主。

图9 合成偶联物诱导抗血清的Tn阳性与CDC分析

        作者利用荧光激活细胞分选（FACS）试验来评估抗血清识别和结合肿瘤细胞表面表达的Tn抗原的能力。以小鼠乳腺癌细胞系TA3Ha和人乳腺癌细胞系MCF-7 Tn抗原阳性细胞系为实验组，选择Tn-阴性肿瘤细胞系MDA231作为对照。同样用这三株细胞测定了补体依赖性细胞毒（CDC）作用。结果显示如图9所有抗血清都能识别并与Tn阳性细胞，表现出较强的结合能力，而与Tn阴性细胞的结合能力较弱。同样在细胞裂解实验中，所有抗血清有效地激活了补体系统，对过度表达Tn抗原的肿瘤细胞均表现出中等至良好的细胞毒性，而对不表达Tn抗原的肿瘤细胞无细胞毒性。在以上所有筛选和验证中MPLA-Tn-KRN7000效果最好，最具备开发为肿瘤疫苗候选药物。

图10 合成偶联物对肿瘤小鼠的保护作用

        为了进一步验证MPLA-Tn-KRN7000作为候选疫苗的潜力，作者对所有偶联物保护小鼠免受肿瘤侵袭的能力进行了评估和比较。为了增强免疫应答，设置了环磷酰胺（CP）与偶联物的联用，以及无环磷酰胺的对照组。通过生存率统计，结果显示图10 A所示，PBS的小鼠在22天内全部死亡。而合成偶联物都能增加小鼠的存活率，MPLA-Tn-KRN7000与环磷酰胺复配组小鼠在50天仍保持62%的存活率。之后对存活的小鼠进行二次肿瘤攻击，图10 B中显示，所有小鼠均能存活，表明存活的小鼠对TA3Ha细胞形成了持久的免疫。

图11 肿瘤攻击后小鼠的免疫学评价

        为了了解免疫保护作用，作者用双抗体夹心法对存活小鼠和死亡小鼠的血清总抗体效价进行检测。与正常小鼠血清相比，存活小鼠的血清表现出很高水平的IgG(图11 A)。MPLA-Tn-KRN7000复配CP组的抗体滴度最高，这可能是其效果最好的原因。作者也选用流式细胞仪检测了抗血清对TA3Ha细胞的识别和结合能力。结果显示（图11 B）存活小鼠的血清与更多的TA3Ha细胞结合。这些结果表明，高水平的Tn特异性免疫球蛋白抗体的产生是存活小鼠抵抗肿瘤攻击的主要原因。值得注意的是，无论是在体外还是在体内，MPLA-Tn-KRN7000的抗癌效果最好。综上所述，本文作者建立了以TLR4配体和iNKT细胞激动剂作为内置佐剂构建全合成自佐剂肿瘤疫苗的新策略。与典型的糖蛋白结合疫苗和双组分全合成疫苗相比，这种三组分疫苗在没有任何外部佐剂的情况下产生了更高的免疫应答，其效果远优于两种双组分疫苗以及其混合物。因此，在后续肿瘤疫苗的开发中，要更多地关注多种信号通路的协同作用，为构建更高效的肿瘤疫苗提供了新的方向。

原文链接：

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2211383522002507

作者：王喆

审核：李全才，吕友晶

编辑：邵萌

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