文章题目：MUC1 Glycopeptide Vaccine Modified with a GalNAc Glycocluster Targets the Macrophage Galactose C-type Lectin on Dendritic Cells to Elicit an Improved Humoral Response

发表期刊： Journal of the American Chemical Society

影响因子：15.0 

通讯单位：School of Biological and Chemical Sciences, University of Galway, University

        Mucin-1（MUC1）是一种细胞表面的糖蛋白，在包括乳腺癌、肺癌、胰腺癌、结肠癌、前列腺癌和卵巢癌的一系列癌症细胞上高表达，并在癌症的发展中起着关键作用。MUC1的胞外结构域由数量不等的SAPDTRPAPGSTAPPAHGVT氨基酸序列串联重复组成，并且序列中的丝氨酸和苏氨酸残基可以被糖基化。肿瘤相关的MUC1的O-连接糖是截断的，支化程度较低，从而区分了肿瘤与正常细胞表面的MUC1，这也为开发特异性识别肿瘤细胞的MUC1疫苗提供了依据。巨噬细胞半乳糖型凝集素（Macrophage galactose-type lectin，MGL）是位于抗原呈递细胞（APC），特别是树突状细胞（DC）和巨噬细胞表面的一种内吞受体。MGL以钙依赖的方式与末端的α-或β-GalNAc残基结合，并能在碳水化合物识别域（CRD）外采用二级结合位点与糖蛋白或二糖结合。MGL在免疫调节中的作用并不完全清楚，但在某些情况下，Tn抗原与MGL的相互作用已被用于促进抗原处理在APCs上的呈递，以及提高免疫系统对肿瘤抗原的免疫力。基于以上背景，该研究构建了新型的三元候选疫苗，该疫苗由能够靶向MGL的三价TPE糖簇配体、P30 T细胞辅助表位和一个抗原性Tn修饰的MUC1糖肽组成。与对照疫苗相比，该疫苗三诱导了更高水平的抗体滴度，并且产生的抗体能够更有效的与MUC1-Tn阳性的T47D人类乳腺癌细胞相结合。

图1：TPE（S-GalNAc）₃-Tetanus Toxold-Mucin1（Tn）₃疫苗靶向APC并诱导高水平抗体示意图

        具有靶向MGL作用的TPE糖簇配体是通过CuAAC反应，将α-S-GalNAc安装到TPE支架上，与此同时，未连接α-S-GalNAc的酚羟基通过酰胺化安装N-Fmoc-Asp-OtBu，并用于后续与MUC1相连（图2）。

图2：TPE（S-GalNAc）₃合成示意图

        构建TPE糖簇配体后，该研究合成了一个小型肽库（图3，肽9-14）用于体外实验。这些肽的C端的氨基酸被生物素化的赖氨酸（KB）替换，用于将肽固定在涂有链霉菌素的ELISA板上，并用于流式细胞仪和荧光显微镜实验中的荧光标记。为了测试TPE糖簇配体对与MGL结合的影响，TPE糖簇配体被引入到肽12-14的N端。为了在体内实验中改善外源糖肽在MHC复合物上的呈现，并激活T细胞，作者还在携带Tn抗原的MUC1 TR（HGVTSAPDTRPAPGSTAPPA）糖肽的N端引入来自破伤风类毒素的T辅助表位P30（FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE），从而获得糖肽疫苗15、16（图3）。

图3：糖肽9-16结构

        接下来作者研究了TPE糖簇配体对多肽与MGL结合的影响。ELISA结果显示，含有TPE糖簇配体的多肽12-14与MGL结合能力要远远强于未修饰TPE糖簇配体的多肽9-11（图4），这证明TPE糖簇配体对多肽与MGL结合的重要性。继续研究发现，修饰有TPE糖簇配体的多肽12能够更有效的被BMDC细胞摄取和内化（图5A，B和图6），并且这种摄取是通过MGL介导的（图5A，C）。

图4：Tn-MUC1糖肽与MGL结合的EC50值

图5：（A）和（B）BMDC细胞对糖肽10-12的摄取ATPE（S-GalNAc）；（C）糖肽12有效阻止了MGL与anti-MGL的结合

图6：荧光显微镜显示BMDC细胞对糖肽10、12的摄取

        在证明了TPE糖簇配体在体外能够促进BMDC细胞对MUC1 TR糖肽的摄取之后，作者研究了糖肽疫苗15、16在小鼠体内对免疫系统的促进作用。研究发现，相比于疫苗15，糖肽疫苗16诱导了更加有效的体液免疫（图7A），并且疫苗16免疫后的血清能够更有效的结合T47D-MUC1肿瘤细胞（图8A，B）。

图7：（A）小鼠免疫策略示意图；（B）糖肽疫苗15、16诱导产生的IgG滴度；（C）IgG亚型分析

图8：糖肽疫苗免疫后血清与T47D-MUC1肿瘤细胞的结合情况

        最后，作者通过糖芯片检测了免疫后血清对不同类型MUC1糖肽的识别能力，分析结果发现，糖肽疫苗16免疫后的血清能够更有效的识别肿瘤细胞表面高表达的MUC1糖肽，不识别正常组织细胞表面表达的MUC1复杂糖肽，这说明疫苗诱导产生的抗体对肿瘤细胞具有特异性（图9）。

图9：免疫后血清对不同类型MUC1糖肽的识别能力

原文链接：https://doi.org/10.1021/jacs.2c12843

作者：汪浩

审核：李全才

编辑：邵萌

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