文章题目：The claim of primacy of human gut Bacteroides ovatus in dietary cellobiose degradation

发表期刊：Gut Microbes

影响因子：9.434

通讯单位：中国科学院上海药物研究所

        纤维素是植物细胞壁的主要成分之一，通过β-1,4-糖苷键连接的D-吡喃葡萄糖基骨架组成，难以被人体胃肠道中的消化酶水解。前期研究表明，从人类粪便中分离出的卵形拟杆菌（Bacteroides ovatus，ATCC 8483）属于优势拟杆菌门，能够利用几乎所有植物和宿主聚糖，包括纤维二糖和β-葡聚糖。因此，丁侃教授团队研究探索了编码纤维素酶的基因，以揭示人类肠道菌群的关键成员Bacteroides ovatus在分子水平上降解纤维二糖的机制。

图1. 肠道微生物在纤维寡糖培养基中生长曲线的检测

        Bacteroides ovatus (BO) 可以利用纤维二糖，Bacteroides cellulosilyticus (BC) 能够分解半纤维素。因此，课题组选择了这两种菌进行研究。首先，测试了在2.5或5 mg/mL纤维二糖作为唯一碳源的培养基中的生长曲线。若没有纤维二糖，BO和BC不能生长。BO在纤维二糖上生长良好，BC生长相比较缓慢。另外，在5 mg/mL纤维二糖中，包括罗伊乳杆菌（LR）、鼠李糖乳杆菌（LGG）和长双歧杆菌（BL）在内的益生菌生长良好。BO在5 mg/mL的纤维四糖上生长。然而，BC和益生菌不能在纤维四糖上生长。这些结果表明BO和益生菌优选纤维二糖作为碳源。为了阐明纤维二糖是如何被这些细菌降解的，课题组选择了BO进行进一步的研究。

图2. 采用TLC对纤维二糖的降解产物进行分析

        BO在纤维二糖中培养的上清点板没有发现葡萄糖，基于此提出了两种猜想：纤维二糖被转运至细胞内消化？BO分解纤维二糖产生的葡萄糖被细胞直接利用？之后，作者分别用葡萄糖(A)和纤维二糖(B)培养BO后，收集细胞，在纤维二糖中培养过夜，发现纤维二糖处理过的细胞(B)上清出现了葡萄糖，说明降解纤维二糖的酶只有在其存在下才表达，可能定位于细胞表面。

        为了证明这一推测，课题组又收集了生长在纤维二糖上的BO，分别用蛋白酶K处理6 h和12 h。去除蛋白酶K后，再次与纤维二糖孵育。结果表明，蛋白酶K处理细胞6 h产生的葡萄糖较少，蛋白酶K处理细胞12 h无葡萄糖产生，进一步证明了该结论。

图3. 利用RNA-seq筛选多糖利用位点，并用RT-qPCR确证

        研究发现，拟杆菌可以通过多糖利用位点 (PUL) 编码碳水化合物酶降解多糖。在这篇文章中，作者发现与葡萄糖中培养相比，纤维二糖中培养BO显著上调了19个基因，可以排列成两个独立的PUL，包括sus转运系统和相关糖苷水解酶。这两个PUL 可能参与了纤维二糖的降解。

图4. 确定两种新的纤维素酶的酶活性

        (a)纤维素酶和聚糖结合蛋白；(b, c)通过免疫荧光和Western blotting测定蛋白质位置；(d–f) BACOVA_02626^GH5、BACOVA_02630^GH5和BACOVA_02745^GH3

        随后，课题组将PUL中的酶都表达纯化出来，发现5种基因在纤维二糖中特异性表达。通过免疫荧光观察到BACOVA_02630^GH5可以从细胞表面检测到，而BACOVA_02626^GH5和BACOVA_02745^GH3不能；但是，在免疫印迹中，BACOVA_02626^GH5和BACOVA_02745^GH3在沉淀中也存在条带，作者给出的解释是，这两种蛋白在细胞表面的表达量很低。在此基础上，作者用蛋白酶K反向验证了这三个蛋白的表达。用高效离子交换色谱(HPAEC-PAD)测试酶活，这三种蛋白均能把纤维二糖降解为葡萄糖。

图5. BACOVA_02626^GH5和BACOVA_02630^GH5的结构生物学(a)BACOVA_02626^GH5结构预测；(b)BACOVA_02630^GH5结构预测；(c, d) BACOVA_02626^GH5催化位点预测；(e, f) BACOVA_02630^GH5催化位点预测；(g)通过对接预测葡萄糖与纤维素酶BACOVA_02626^GH5的结合；(h) 通过对接预测葡萄糖与纤维素酶BACOVE_02630^GH5的结合。

        为探究BACOVA_02626^GH5和 BACOVA_02630^GH5的催化机理，作者进行了分子结构预测，并通过对接预测了葡萄糖与纤维素酶的结合。结果显示， BACOVA_02626的催化残基为Glu154和Glu241（橙色箭头所示）；BACOVA_02630的催化残基为Glu181和Glu293（蓝色箭头所示）。这为更好地理解纤维素酶如何消化β-1,4葡萄糖苷键提供了信息。

图6. 基于16S rRNA多样性测序分析纤维二糖对肠道菌群组成的作用

        作者探究了纤维二糖对低纤维饮食小鼠肠道菌群的作用。发现补充纤维二糖后，虽然小鼠体重并没有显著变化，但肠道菌群组成改变，其中Alistipes spp.显著富集。BO和LR的丰度也有所升高，这与前面体外单菌发酵的结果一致。

图7. 细菌代谢功能的预测和炎症因子的检测

        对49个预测的代谢通路进行聚类分析，发现微生物组代谢途径对纤维二糖具有相对特异性。预测与碳水化合物代谢相关的酶，只有β-N-乙酰氨基己糖苷酶，α-葡萄糖苷酶和β-半乳糖苷酶显示出差异。代谢相关的KEGG通路包括组氨酸、甲烷、维生素B6和叶酸生物合成在纤维二糖处理后显著富集。β-N-乙酰氨基己糖苷酶和组氨酸被LR代谢为组胺，被证明可以抑制结肠的炎症，因此课题组分析了炎症因子TNF-α和IL–6，发现纤维二糖处理后，mRNA表达水平显著降低。给予纤维二糖后，H2R（组胺H2受体）的mRNA表达水平显著增加。这些结论表明，纤维二糖可能会改变细菌的代谢功能。

图8.人体肠道B. ovatus 降解纤维二糖模型

        这篇文章主要是基于卵形拟杆菌，表达并纯化了两种新型的纤维素降解酶，同时探究了纤维二糖对小鼠肠道菌群的重塑作用，揭示了膳食饮食中纤维二糖的代谢机制及其潜在的药理活性。

        原文链接：10.1080/19490976.2023.2227434

作者：房子怡

审核：李全才，吕友晶

编辑：邵萌

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