文章题目：Lysosome Targeting Chimaeras for Glut1-Facilitated Targeted Protein Degradation

发表期刊：JACS（2024.06）

影响因子：14.4

通讯单位：中国科学院深圳先进技术研究院

        蛋白质降解是维持细胞正常生命活动的一个关键过程，包括蛋白酶体和溶酶体两种途径。随着对内吞-溶酶体和自噬-溶酶体降解途径的深入探索，近年来出现了通过溶酶体途径靶向降解蛋白质（targeting protein degradation, TPD）的策略。Glut1是人类葡萄糖转运蛋白之一，研究表明Glut1在多种人类肿瘤细胞中高表达，并在肿瘤增殖过程中发挥重要作用；除此之外，Glut1与特定大分子（如蛋白质-糖聚合物共轭物）相互作用后，Glut1通过内吞过程促进其内化，形成早期内体，降解大分子。这表明Glut1不仅是肿瘤治疗的靶点，也是溶酶体靶向的潜在受体。

        这篇文章中，作者利用Glut1作为溶酶体靶向受体，并设计了Glut1促进靶蛋白溶酶体降解策略。作者通过可逆加成-断裂链转移（RAFT）聚合合成了聚糖聚合物作为潜在的Glut1配体，并通过生物正交反应获得了抗体-聚糖聚合物的共轭物，作为溶酶体靶向蛋白降解分子，可作为治疗高表达PD-L1的三阴性乳腺癌的潜在治疗剂。

        作者以丙烯酰基葡萄糖和半乳糖单体通过 RAFT 聚合与荧光素单体（FITC）共聚制备了带有荧光标记的五种葡萄糖和/或半乳糖的聚糖：Gal⁶, Gal⁴Glc², Gal²Glc⁴，Glc⁶，和Glc²⁴（Figure 1a and b）。获得五种聚糖后，作者通过计算机模拟（Figure 1c）和SPR（Figure 1d）评价了聚糖与Glut1的结合能力，发现五种聚糖均能够与Glut1实现有效结合。

Figure 1. Characterization of promising Glut1 ligands.

        为了进一步筛选潜在的Glut1配体，作者检测了高表达Glut1的MDA-MB-231 和MCF-7细胞系对FITC 标记聚糖吸收情况。流式细胞仪分析表明，聚合度较高的聚合物Glc²⁴，细胞吸收率较低；与此相对，Gal⁶、Gal⁴Glc²和Glc⁶的摄取水平较高（Figure 2a and b），因此作者采用以上三种聚糖进行进一步研究。

Figure 2. Screening of Glut1 ligands in MDA-MB-231 cell line.

        作者通过激光扫描共聚焦显微镜观察发现，Gal⁶、Gal⁴Glc²和Glc⁶在内化后与溶酶体呈现高度共聚共定位（Figure 2c-e）；进一步使用溶酶体抑制剂氯喹或Glut1抑制剂BAY-876处理 MDA-MB-231 细胞1小时，然后让细胞与Gal⁶、Gal¹Glc²和Glc⁶共孵育发现，氯喹和BAY-876可阻碍聚糖的内化，这表明细胞对聚糖的吸收是通过Glut1介导溶酶体途径进行的（Figure 2f）。

        在确定聚糖可通过Glut1介导溶酶体途径被细胞摄取后，作者进行了LYTAC的构建。以MDA-MB-231细胞系中高表达的免疫检查点PD-L1为靶点， 采用PD-L1 抗体Avelumab来合成LYTAC。具体而言，聚糖末端的链转移剂经过氨解暴露出游离巯基，随后通过巯基与马来酰亚胺的正交反应在聚糖末端安装叠氮官能团，随后通过click反应与Avelumab连接，成功构建了三种LYTAC:Ave- Gal⁶、Ave- Gal⁴Glc²和Ave- Glc⁶（Figure 3）。

Figure 3. Syntheses Route of Ave–Glycooligomer Conjugates.

        获得三种LYTAC之后，作者验证其降解靶蛋白PD-L1的能力。激光共聚焦和WB结果显示，三种LYTAC均能够以浓度依赖性的方式降低MDA-MB-231中PD-L1的表达量，其中Ave-Glc⁶降解能力最强（Figure 4）。

Figure 4. Concentration-dependent variation of protein degradation activity of Ave–glycooligomer conjugates..

        作者进一步研究了LYTAC与MDA-MB-231细胞共孵育时间对PD-L1降解水平的影响。结果显示，LYTAC长时间的处理不但没有提高PD-L1的降解水平，反而在24h后，PD-L1的水平增加了（Figure 5a）。进一步研究发现PD-L1的表达水平与Glut1相关（Figure 5b），这说明PD-L1与LYTAC以及Glut1可能形成了逆运复合体，造成在溶酶体中未能完全降解的PD-L1重新转运到细胞表面。因此，在下一代LYTAC设计中，作者提出可加入pH响应的linker，实现在溶酶体中靶蛋白的精准释放，防止逆运复合体的形成。

Figure 5. Variation in targeting protein degradation efficiency of Ave–glycooligomer conjugates over time and its mechanism.

原文链接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.4c02463

作者：汪浩

审核：李全才、吕友晶

编辑：邵萌

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