文章题目：Chemoenzymatic Synthesis of Heparan Sulfate Oligosaccharides having a Domain Structure

发表期刊 : Angewandte Chemie International Edition

影响因子 : 16.823（2021）

通讯单位 : 乌特勒支大学，佐治亚大学

        硫酸乙酰肝素（Heparan sulfate, HS）主要是由糖醛酸和葡萄糖胺通过 1,4 糖苷键连接的二糖重复单元组成的硫酸化线性多糖，广泛存在于哺乳动物细胞表面和胞外基质中。目前，已有大量研究表明，硫酸乙酰肝素在众多生理过程中发挥重要作用，如胚胎发育、炎症响应、细菌/病毒传染和血液凝结。然而，由于糖醛酸的差向异构化以及硫酸化修饰位点的不确定性，导致HS存在结构多样性，结构不明确，不利于深入阐明HS结构与活性的关系。除糖单元的异构化以及硫酸化修饰造成的结构多样性以外，HS的额外结构复杂性来自于结构域的形成，高度硫酸化修饰的区域（NS domain）与没有硫酸化或非常有限的硫酸化修饰（NA domain）的区域相间（Figure 1），其中NS结构域的间距可以调节HS与蛋白质的相互作用，例如CXCL5、CCL8、IFN-γ、PF4，以及CCL3，然而，这种结构与生物活性之间的关系一直难以探究。

Figure 1. Heparansulfate domain architectures. HS has a domainstructurein which sulfonated fragments(NS) are interspersed with unmodified fragments(NA).

        这篇文章中，Boons及其合作者利用化学酶法，构建了含有两个或更多的NS domain和不同长度的NA domain结构明确的HS寡糖模拟物，并通过SPR竞争性结合研究发现，NA结构域的长度可以调节趋化因子CCL5和CXCL8的结合。首先，用于酶促延长的六糖1是由三个二糖单元15-17通过两步Schmidt糖苷化以及随后的正交脱保护、选择性硫酸化合成的（Scheme 1）。获得六糖1之后，作者使用PmHS2在非还原端继续进行酶促延伸，以构建不同长度的NA domain，得益于PmHS2对6N₃-GlcNAc高底物耐受性，可以方便的在NA domain末端添加叠氮官能团，从而获得六糖3-8(Scheme 2A)。与此同时，六糖1通过与NHS活化的炔基戊酸反应获得还原端含有炔基官能团的六糖2(Scheme 2B)。

Scheme 1. Chemical synthesis of hexasaccharide 1.Reagents and conditions: (a) DCM/Et₃N(4/1), 2 h; Ac₂O, Py., 3 h; (b) NH₂NH₂·AcOH, Toluene/EtOH(1/2), 2 h; SO₃·Py, DMF, 2 h; (c) 1.0M LiOH, 30% H₂O₂, THF/H₂O(1/1); 51% over five steps; (d) 1.0 M PMe₃ in THF, 0.1 N NaOH, 2 h; (e) SO₃·Py, MeOH, Et₃N, 0.1 N NaOH; 50% over two steps; (f) Pd(OH)₂/C, H₂(atm.), t-BuOH/H₂O(1/1), 48 h; 85%.

Scheme 2. Chemoenzymatic synthesis of HS mimetics having two NS domains separated by an NA domain of different length.(A). Compound 1 was transformed to 23-27by repeated enzymatic extension using PmHS2 in combination with UDP-GlcNAc and UDP-GlcA step by step, resulting compounds 23-27 and unmodified 1were capped with GlcNAc-N₃ to obtain 3-8. (B). Compound 1 was functionalized with an alkyne moiety by treatment of N-hydroxysuccinamide (NHS)-activated 4-pentynoic acid in a mixture of 0.3 M NaHCO₃/acetonitrile/MeOH (5/5/1) to give 2. (C). Compounds 9-14 with two NS domains separated by an NA domain of defined length were obtained by CuAAC click reaction of 2 with 3-8, respectively.

        为了构建含有两个NS domain的HS模拟物，作者使用THPTA作为Cu（I）稳定剂，在37℃的温度下进行CuAAc反应，24h后以较高收率获得HS模拟物9-14(Scheme 2C)。含有三个NS domain的HS模拟物31-33，以类似的方式构建获得(Scheme 3)。

Scheme 3. Chemoenzymatic synthesis of HS mimeticsbearing three NS domains separated by well-defined NA domains. (A) Preparation of alkyne modified compounds 28,29, and 30 with two NS domains separated by a NA domain of defined length. (B) Structure of acceptors 3, 4, and 5 with terminal azide group. (C) Assembly of 31-33 having three NS domains separated by two NA domains via CuAAC click reaction.

        获得含有多个NS domain的HS衍生物后，作者通过核磁共振光谱（NMR）对其进行了结构确证，其中非还原GlcNAc上H5、H6向低场移动，H1和H4向高场移动以及炔基氢的消失、三氮唑杂环氢的出现，均证明CuAAc反应的成功(Figure 2C and D)。

Figure 2.Analysis of synthetic compounds by NMR spectroscopy. ¹H NMR stacked plots and structures of compounds 2, 3, and their CuAAC product 9. (A) Structures of compounds 2, 3, and 9, sugar rings are labelled alphabetically, starting from reducing to non-reducing end. (B) ¹H NMR of hexasaccharide 2 where anomeric linker is extended with alkyne functionality; characteristic protons are annotated. (C) ¹H NMR of compound 3 with terminal GlcNAc-6N₃; characteristic protons are annotated. (D) ¹H NMR of CuAAC product of 2 and 3, HS mimetic 9.

        最后，作者使用表面等离子体共振（Surface plasmon resonance, SPR）来检测不同HS模拟物对肝素与CXCL8和CCL5结合的竞争性抑制作用。对于CXCL8，含有两个NS domain的化合物9和含有三个NS domain的化合物31和32与六糖1相比表现出更强的抑制作用。与此同时，含有两个NS domain的化合物随着NA domain的延长，其抑制活性表现出先降低后提高的趋势（Figure 3E）。基于SPR的实验结果，作者提出了一个模型，其中两个NS domain通过一个足够长的NA domain连接，可以在二聚体蛋白上的两个反平行的螺旋区域上以马蹄形方式与二聚体蛋白的两个结合点接合（Figure 3F）；最近的核磁共振和分子动力学模拟表明，CXCL8的结合面在结构上是可塑的，而且还发现了额外的垂直结合模式，这种模式需要较短的HS寡糖来实现高强度的结合（Figure 3F）；而NA domain的长度介于这两种情况之间，则会与CXCL8以单价的形式结合，从而表现出极低的结合能力（Figure 3F）。对于CCL5，含有两个NS domain的化合物9表现出较强抑制作用。与此同时，化合物10和11在NA domain中有一个或两个额外的GlcNAc-GlcA单元，其抑制作用与9相比轻微降低，而化合物12和13显示抑制活性则进一步降低。因此，具有最短和最长NA domain的HS模拟物具有最强的CCL5的结合能力，表明这些趋化因子与HS的相互作用是复杂的，涉及与CXCL8不同的结合模式。

Figure 3.Surface Plasmon Resonance (SPR) binding assay and SPR competition  inhibition assay.

原文链接：

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/anie.202211112

 作者：汪浩

审核：李全才，吕友晶

编辑：邵萌

如有侵权，请联系删除