文章题目：Exploiting Substrate Specificities of 6-O-Sulfotransferases to Enzymatically Synthesize Keratan Sulfate Oligosaccharides

发表期刊：JACS Au

影响因子：8.0（2022）

通讯单位：Utrecht University

        今天分享的是Geert-Jan Boons教授课题组10月12日在《JACS Au》杂志上在线发表的关于硫酸角质素低聚糖酶法合成的研究。

图1. 酶法合成KS寡糖并通过糖芯片分析糖-蛋白相互作用

        不同亚型的糖胺聚糖通过独特的糖单元与核心蛋白相连，其中硫酸角质素(Keratan sulfate, KS)由硫酸化的聚-N-乙酰乳糖胺(poly-N-acetyl-lactosamine, poly-LacNAc)组成的二触角糖链，并以N-连接或O-连接的形式存在于蛋白质主链上的有限位置。不同亚型的糖胺聚糖通过独特的糖单元与核心蛋白相连，其中硫酸角质素(Keratan sulfate, KS)由硫酸化的聚-N-乙酰乳糖胺(poly-N-acetyl-lactosamine, poly-LacNAc)组成的二触角糖链，并以N-连接或O-连接的形式存在于蛋白质主链上的有限位置。硫酸角质素有两种亚型，硫酸角质素I (KS I)最初在角膜中被检测到，其二触角N-聚糖链通过天冬酰胺Asn残基连接在蛋白质上，其中一个长触角由LacNAc重复二糖单元组成，并在GlcNAc或Gal单糖上带有6-O-硫酸化修饰，GlcNAc的6-O-硫酸化修饰发生在非还原末端残基上，Gal的6-O-硫酸化发生在非还原末端和糖链内部，优先发生在6-O-硫酸化的GlcNAc残基相邻的Gal单元，在非还原末端的Gal6S残基阻止了LacNAc糖链的进一步延长，同时会修饰上唾液酸化修饰的“帽子”；而短触角糖链由于唾液酸化“帽子”提前修饰LacNAc导致糖链延长提前终止；部分KS在核心五糖结构中还带有岩藻糖基化修饰。

图2. 天然KS I糖链的结构示意

        关于KS寡聚糖的酶法合成方法主要分为两部分，即糖基转移酶延长LacNAc糖链和6-O-磺基转移酶对GlcNAc或Gal残基进行硫酸化修饰。LacNAc糖链延长部分主要由β(1,3)-N-乙酰氨基葡萄糖转移酶(B3GnT)和β(1,4)-半乳糖基转移酶(B4GalT)的连续作用来完成（如图3a所示）。B4GalT酶家族中的B4GalT1和B4GalT7可以将1,4-Gal糖苷转入GlcNAc残基，但当非还原末端的GlcNAc被GlcNAc-6-O-磺基转移酶2或6(CHST2/6)进行6-O-硫酸化后，只有酶B4GalT4可以将Gal转入6-磺基-GlcNAc残基（如图3b所示）； CHST2/6可以对非还原末端的GlcNAc残基进行6-O-硫酸化修饰，硫酸角质素半乳糖6-磺基转移酶(KSGal6ST/CHST1)或软骨素磺基转移酶-1(C6ST1)可对Gal残基进行6-O-硫酸化修饰（硫酸化修饰规律如文首所述），这些酶与其他磺基转移酶一样，使用活化的硫酸盐（[3'-磷酸腺苷基-5'-磷酸硫酸盐], PAPS）作为高能供体。当LacNAc糖链完成酶法合成后，β-半乳糖苷-α-2,3-唾液酸转移酶4 (ST3Gal4)和β-半乳糖苷-α-2,6-唾液酸转移酶1(ST6Gal1) 可以将2,3-或 2,6-连接的唾液酸“帽子”转入非还原末端的Gal残基（如图3c所示）。

图3. 线性KS 低聚糖链的酶法合成方法 (R = O(CH₂)₅NHCbz)

        Boons课题组选择使用B3GnT2、B4GalT1两种糖基转移酶，以LacNAc二糖1 (异头位带有NHCbz-linker)为起始底物通过交替酶法延长，制备无硫酸化修饰的系列LacNAc低聚糖2-6（如图3a所示）。之后使用磺基转移酶CHST2和PAPS以高选择性成功对三糖2和五糖4的末端GlcNAc残基进行了6-O-硫酸化修饰，证实了CHST2的对末端GlcNAc残基的专一选择性，之后选用特异性的糖基转移酶B4GalT4在带有硫酸化修饰的三糖7和五糖9的基础上延长Gal残基制备四糖8和六糖10（如图3b所示），在此基础上继续验证了GlcNAc6S并不会阻碍非还原端2,3/6-唾液酸化修饰（如图3c所示）。之后研究者将注意力放在了磺基转移酶CHST1的区域选择性上，通过以LacNAc五糖4、六糖5和七糖6为底物，证实CHST1主要对糖链内部的Gal进行硫酸化修饰，而对非还原末端的Gal残基不进行硫酸化修饰（如图4a所示）；当以非还原末端含GlcNAc6S残基的六糖10为底物时，得到了单一产物六糖19，以高位点选择性在GlcNAc6S靠近还原端一侧(-1)的Gal上进行了6-O-硫酸化，而不会影响其无法硫酸化非还原末端Gal残基的特性，初步证实CHST1对带有GlcNAc6S的糖残基进行硫酸化修饰时具有区域选择性；当LacNAc糖链末端带有唾液酸化修饰时，无法进行硫酸化修饰，证明唾液酸化修饰会使Gal残基失活（如图4b所示），但是同时具有GlcNAc6S残基和唾液酸化修饰末端的LacNAc糖链可以被CHST1在靠近非还原端一侧(+1)的Gal残基进行6-O-硫酸化修饰，并且在进一步孵育后在(-1)侧的Gal残基也可以进行6-O-硫酸化修饰，证实GlcNAc6S残基可以活化其相邻的Gal残基从而被硫酸化修饰（如图4c所示）。

图4. 磺基转移酶CHST1的区域选择性研究

        在掌握磺基转移酶CHST1和CHST2区域选择性规律的基础上，研究者使用目前较为成熟的方法，从蛋黄中提取分离得到了双天线N-糖肽SGP，并通过酶解去除末端唾液酸，使用对MGAT1天线具有偏好性的唾液酸转移酶ST6Gal1引入一侧的末端唾液酸从而实现去对称化，得到单唾液酸修饰的N-糖肽底物24。以24为起始底物，研究者合理的使用他们选用的糖基转移酶B3GnT2、B4GalT1和B4GalT4，以及磺基转移酶CHST1和CHST2，合成了系列结构明确的KS I糖肽25-33（如图5所示）。

图5. 合理利用CHST1/2的区域选择性通过酶法合成KS I糖肽

        最后，研究者选取了三类化合物，分别是合成的系列KS I低聚糖A-L、系列KS I糖肽M-P、O-糖链形式的KS II低聚糖Q-S，构建聚糖微阵列，对多种植物凝集素和半乳糖凝集素-3 (Gal-3)（图6b）、唾液酸结合免疫球蛋白型凝集素(Siglecs)（图6c）以及动物和人类流感病毒的重组血凝素(HA) （图6d-g）进行糖-蛋白相互作用分析，并给出了以下结论：接骨木凝集素SNA主要识别α2,6-连接的唾液酸苷，GlcNAc的硫酸化不影响凝集素的识别；怀槐凝集素I (MAL-I)和怀槐凝集素II (MAL-II)主要识别α2,3-连接的唾液酸苷，MAL-I不耐受GlcNAc6S残基而MAL-II可以耐受GlcNAc6S残基，二者均不耐受Gal6S残基；半乳糖凝集素-3倾向于识别较为延伸的LacNAc糖链，在LacNAc糖链上的任意硫酸化都会降低糖链与Gal-3的结合能力。Siglecs-8只结合含有GlcNAc6s邻基有Gal6S的糖苷（如L、O、P、S）；Siglecs-9结合带有Neu5Ac-α-2,3-Gal-β-1,4-GlcNAc6S表位的N-糖肽（N），而不结合带有该表位的O-糖肽（R）；Siglec-2 (CD22)识别α2,6-连接的唾液酸苷，并能耐受GlcNAc的硫酸化修饰；Siglec-3 (CD33)与Siglecs-8的识别模式类似。禽类甲型流感病毒优先结合 2,3-连接的唾液酸苷，而人类甲型流感病毒则识别α2,6-连接的唾液酸苷。源自鸭H3N8和H4N6病毒的重组HA与α2,3-连接的唾液酸苷结合，并初步耐受硫酸化修饰，但不耐受Gal的过度硫酸化修饰，源自斑海豹H3N8病毒的重组HA仅对GlcNAc的硫酸化耐受，并对含有Neu5Ac2,3-Gal-GlcNAc6S表位的O-糖肽（Q、R）具有最强的结合能力，系列H5蛋白也对带有该表位的O-糖肽表现出明显的偏好性，来自鸡H6N1病毒的重组HA只结合带有GlcNAc6S的KS糖链，并耐受Gal的硫酸化，且倾向于结合O-糖肽。两种人类H3N2病毒仅与α2,6-连接的唾液酸苷结合，并且耐受GlcNAc6S残基。

图6. 凝集素、聚糖结合蛋白和甲型流感血凝素结合KS I聚糖的构效关系

        在本文中，Boons课题组通过底物探索给出KS寡糖酶法合成中磺基转移酶CHST1/2的区域选择性规律，即GlcNAc6S 部分和α2,3-唾液酸化决CHST1硫酸化的首选位点，CHST2仅修饰末端GlcNAc。合理利用糖基转移酶和磺基转移酶制备了一系列具有明确结构的KS I寡糖和糖肽，并利用这些化合物和几种参考衍生物制备成聚糖微阵列，揭示了一系列凝集素、聚糖结合蛋白和甲型流感病毒HA的结合选择性。

原文链接：https://doi.org/10.1021/jacsau.3c00488

作者：王礼浩

审核：李全才，吕友晶

编辑：邵萌

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