文章题目：Fucoidan reduces NET accumulation and alleviates chemotherapy-induced peripheral neuropathy via the gut–blood DRG axis

发表期刊：Journal of Neuroinflammation

影响因子：9.3

通讯单位：南京医科大学

        目前化疗药物治疗仍是癌症治疗的有效方法，但这种方法经常会诱发化疗引起的周围神经病变（CIPN），如肢体麻木、感觉减退，目前针对CIPN的唯一建议是暂停或延迟化疗。中性粒细胞胞外捕获器（NET）是从活化的中性粒细胞膜上突出的纤维网状物，存在于多种疾病中，如感染、恶性肿瘤等。研究表明，诱导 NET形成的因素包括 p-选择素、HMGB1、真菌等。体内LPS/HMGB1水平的降低是由于与相应的内源性配体结合引起的炎症反应，同时LPS/HMGB1也会被吞噬细胞吸收并清除。作者检测了经L-OHP刺激后巨噬细胞表面的几种LPS/HMGB1相关识别受体。筛选结果显示，SR-A1受体在L-OHP组中明显下调。SR-A1是先天性免疫中重要的模式识别受体，可识别LPS/HMGB1。岩藻多糖是具有良好的抗炎作用，已被证明可通过上调SR-A1治疗肥胖者的高血压。因此，作者推测岩藻多糖也可能缓解 CIPN。

        通过测定化疗前后癌症患者血浆中组蛋白H3（H3Cit，NET的标记物）的含量，来验证NET在CIPN中的关键作用。如图1A所示，化疗后血液中H3Cit的累积量增加。进一步分析发现，H3Cit含量与CIPN患者的VAS评分呈正相关（图1B）。研究证实，NET的形成在促进凝血、血管闭塞和血栓形成方面发挥作用。结果表明，化疗导致组织因子（TF）在CIPN患者血液中蓄积（图 1C），并伴随着手部血液循环的减少。随着化疗周期的增加，肢体缺血加剧（图 1D和E）。

图1：(A）用酶联免疫吸附法检测化疗前（对照组）和化疗后（CIPN）肿瘤患者血浆中H3Cit 的含量。(B）最后一次化疗后，研究CIPN患者血浆中H3Cit浓度与VAS评分之间的相关性。(C) 用WB法检测化疗前后肿瘤患者血浆中TF的含量。(D) (E) 通过激光多普勒成像检测肿瘤患者化疗前、化疗后7天、21天和 35天的手部血流量。

        为了进一步验证LPS/HMGB1/NET参与CIPN的病理机制，作者在B6/C57小鼠中连续注射药物L-OHP5天，建立了CIPN小鼠模型。 L-OHP可明显诱导小鼠机械过敏（图2A），并增加血液（图2B）和背根神经节（DRGs）（图2C和D）中的H3Cit水平。NET的形成导致高凝状态、组织因子上调（图2E）、体内弥散性血管内凝血以及神经末梢和肠道严重的微循环障碍（图2F-H），最终激活金属蛋白酶9（MMP9）（图2I）并促进CIPN的发展。作者测定了小鼠血浆和DRG中LPS的含量。如图2J、K所示L-OHP增加了血浆和DRG中LPS的积累水平。化疗后，血液中的LPS可能来自受损的肠道。血栓素-伊红染色显示，L-OHP导致小鼠肠壁变薄和腺体萎缩（图2L），并增加了肠道的蠕动性（图2M）。除LPS外，HMGB1也会在化疗过程中大量产生，并参与NET的形成。作者测量了小鼠血浆中的HMGB1水平，并证实了小鼠在化疗过程中也会产生HMGB1（图2N）。

图2： (A) 通过给小鼠注射L-OHP 5天，建立CIPN模型。(B) (C) 第一次注射L-OHP后第10天收集小鼠血浆和 DRG，用 ELISA 检测H3Cit含量。(D）免疫荧光染色评估DRG中H3Cit的表达。 (E)血浆中的TF水平通过WB检测。(F) (G) (H) 通过激光多普勒成像检测小鼠足底微循环状况和肠道微循环状况。(I）通过明胶酶谱检测小鼠血浆中MMP9的活性。(J) (K) 通过ELISA检测血浆和DRG中LPS的含量。(L)用4% 多聚甲醛固定小鼠肠道并进行HE染色。(M)第一次注射 L-OHP后的第10天，用酶标仪检测血清中FITC-葡聚糖的浓度。(N)用WB法检测小鼠血浆中HMGB1的表达。

        作者提取了WT小鼠的BMDMs，并用L-OHP对其进行刺激，以进一步探索LPS/HMGB1大量积聚的机制。在培养基中加入重组FITC-LPS以研究巨噬细胞对LPS的吞噬作用。图3A中的结果表明，L-OHP处理后，BMDMs对FITC-LPS的摄取减少。作者还发现L-OHP抑制了FITC HMGB1的吞噬作用（图3B）。为了研究巨噬细胞吞噬LPS/HMGB1能力下降的原因，作者测定了巨噬细胞膜上能与LPS/HMGB1结合的受体的mRNA水平。如图3C所示，TLR4/TLR2和其他与炎症信号通路相关的受体的mRNA水平升高，而清除受体SR-A1的表达则下降。随后检测SR-A1蛋白的水平，如图3D所示，L-OHP处理后，SR-A1在BMDMs中的表达明显下降。 这些结果表明，L-OHP可降低SR-A1的表达，抑制巨噬细胞对LPS/HMGB1的清除。在体内，L-OHP还可抑制肠道中SR-A1受体的表达，从而抑制LPS/HMGB1的清除。

图3：(A) (B) L-OHP刺激12小时后分别加入FITC-LPS、FITC-HMGB1，在共聚焦显微镜下观察BMDMs对 FITC-LPS的吞噬作用(C)取自WT小鼠的BMDMs，用L-OHP刺激18 h后，提取总RNA，并通过qPCR检测SR-A1、Scara3、Marco、LRP1、CD36、TLR4、TLR2 和 RAGE 的 mRNA 水平。(D) 取自WT小鼠的BMDMs，用 L-OHP刺激18小时后收集细胞，用WB检测SR-A1的表达。

        如图4A所示，作者发现岩藻多糖提高了SR-A1受体的表达（图4B），并促进了 BMDMs 对FITC-LPS和FITC HMGB1的吞噬（图4C和D）。在体内，岩藻多糖减轻了L-OHP诱导的机械痛（图4E）。进一步检测岩藻多糖对小鼠肠道和DRGs中SR-A1表达的影响发现，岩藻多糖上调了肠道和DRG中SR-A1受体的表达（图4F和G）。此外，岩藻多糖减少了LPS在CIPN小鼠血浆和DRG中的积累（图4H和I），降低了HMGB1的含量（图4J），从而抑制NET的形成，降低了血液中的H3Cit水平（图4K和L）。

图4： (A) (B)收集细胞，用WB检测SR-A1的表达。(C) (D)共聚焦显微镜下观察BMDMs对FITC-LPS和FITC-HMGB1的吞噬作用。(E)建立小鼠CIPN模型，并通过Von Frey试验检测机械痛阈值。(F)首次注射 L-OHP后第10天，通过WB检测肠道组织中SR-A1的表达水平。(G)收集小鼠的DRGs，研究SR-A1的表达水平。(H) (I) 通过ELISA检测血清和DRG中LPS的含量。(J)收集小鼠血浆检测HMGB1水平。(K)通过ELISA检测血浆中的H3Cit含量。

        作者又利用SR-A1-/-小鼠来评估岩藻多糖的治疗效果和相关参数，进一步研究SR-A1在岩藻多糖抗CIPN作用中的重要作用。与治疗组相比，SR-A1基因敲除后岩藻多糖对LPS/HMGB1、MMP-9和TF水平的影响无效。体外实验结果证实，岩藻多糖促进了BMDMs对FITC-LPS和FITC-HMGB1的吞噬作用，但SR-A1基因敲除后这种作用被抵消了（图5A和B）。作者用His标签-HMGB1代替了FITC HMGB1，并通过WB分析了His标签蛋白的表达，以探讨BMDMs对His标签-HMGB1的吞噬作用。结果表明，岩藻多糖增加了BMDMs对His标签-HMGB1的吞噬作用，而SR-A1基因敲除也减弱了这种作用（图5C）。

图5：SR-A1在岩藻多糖治疗CIPN中发挥关键作用。(A) (B) BMDMs取自SR-A1-/-小鼠和WT小鼠。在共聚焦显微镜下观察BMDMs对FITC-LPS和FITC-HMGB1的吞噬作用。(C) 收集细胞蛋白，用WB法检测不同组别BMDMs对His标记-HMGB1的吞噬作用。

        原文链接：https://doi.org/10.1186/s12974-025-03431-5

作者：张兰梅

审核：李全才、邵萌

编辑：郭青云

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