文章题目：Construction of AgNPs-loaded oriented hydrogel based on Periostracum Cicadae chitosan by electro-assembly for rapid hemostasis and wound healing

发表期刊：Carbohydrate Polymers

影响因子：10.5

通讯单位：湖北中医药大学

        皮肤是人体最大的器官，在抵御外部威胁、调节体温和感知刺激等方面发挥着重要作用，然而，手术、烧伤或其他损伤会对皮肤的结构和功能造成不同程度的损害，传统的敷料，如纱布、绷带，往往不能充分解决伤口的特殊症状或并发症。水凝胶具有模仿细胞外基质（ECM）的三维（3D）结构，能够保持水分、促进氧气渗透并释放生物活性因子。壳聚糖是一种天然聚合物，因其毒性低、生物相容性好、可生物降解以及具有多种生物活性而被广泛用于制备水凝胶。蝉蜕（Periostracum Cicada）是从黑蝉脱落的外骨骼中提取的一种中国传统粗制药物，应用历史源远流长。

        在这篇文章中，作者通过盐酸脱盐、氢氧化钠脱蛋白、高锰酸钾和亚硫酸氢钠脱色等方法纯化了蝉蜕中的甲壳素。利用碱性溶液对甲壳素进行脱乙酰化，制备出了蝉蜕甲壳素（PC-CH）。图1a-c展示了蝉蛹的照片和PC-CH的扫描电镜图像。在PC-CH表面观察到均匀的结构和清晰的孔隙。图1d和图1f显示，空白组无凝血现象，相比云南白药处理组，PC-CH组的凝血时间更短。随后，如图1e、图1g 和图1h 所示，作者用体内小鼠尾部损伤模型对紧急止血性能进行了研究，通过测量了止血前的失血量和止血所需时间，来定量评估止血能力。研究表明，PC-CH的止血效果优于云南白药。

图1：(a) 蝉蜕和 (b) PC-CH 的照片。(c) PC-CH 的扫描电镜图像。(d）体外凝血的照片和（f）凝血时间。(e）截尾止血小鼠的照片、（g）止血时间（h）失血量

        O-CH@Ag20的制备过程如图2a所示。图2b中的照片显示了沉积在阴极表面的O-CH水凝胶，可以轻松实现剥离（图2c）。O-CH@Ag20 的照片见图2d-e，呈深棕色。扫描电子显微镜图像（图2f-h）显示其顶部疏松，底部致密，横截面呈多层排列。SEM图像（图2i）显示了多层O-CH@Ag20水凝胶中单层的横截面。EDS图谱（图2j-m）证实了Ag元素在整个水凝胶基质中的一致和均匀分布。

图2：(a) O-CH@Ag20水凝胶敷料的制备示意图。 (b, c) O-CH和(d, e)O-CH@Ag20的照片。扫描电镜图像显示了O-CH的（f）顶部、（g）底部和（h）横截面微观结构。(i) SEM图像和(j-m) EDS图谱显示了O-CH@Ag20的横截面。

        接着，作者选择了三种已知会导致伤口感染的常见细菌菌株--RSA、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌，以评估O-CH、O-CH@Ag1、O-CH@Ag10和O-CH@Ag20水凝胶的抗菌特性。如图 3a-b所示，O-CH@Ag1、O-CH@Ag10和O-CH@Ag20水凝胶比O-CH显示出更明显的抑菌区。随着AgNPs含量的增加，抑制区的面积也逐渐增大。使用活/死染色法进一步验证了水凝胶的杀菌效果。未经处理的细菌细胞和经O-CH处理的细胞都呈现出鲜艳的绿色荧光，这表明大部分细菌都是活的。然而，暴露于O-CH@Ag1、O-CH@Ag10和O-CH@Ag20水凝胶后，大多数细菌细胞染成红色，表明它们已经死亡（图 3c）。如图3d-f所示，随着AgNPs含量的增加，活菌数逐渐减少，O-CH@Ag20组的活菌数少于O-CH@Ag10组。

图3：水凝胶的体外抗菌活性评估。(a) 抑制区和 (b) 相应的定量分析。(c) MRSA、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌与水凝胶共孵育 6 小时后的荧光显微镜图像（钙黄绿素-AM/PI 双荧光染色）。(d) MRSA、(e) 金黄色葡萄球菌和 (f) 大肠杆菌的活/死细菌染色定量分析

        随后，作者使用L929成纤维细胞通过活/死染色法评估了O-CH和O-CH@Ag20水凝胶的细胞毒性。如图4a所示，实验组的细胞活力与对照组相似，活细胞呈纺锤形（绿色）。只观察到少数孤立的死细胞（红色）。对相对生长率的进一步量化显示，如图4b，与对照组相比，在O-CH和O-CH@Ag20水凝胶提取物中培养的L929成纤维细胞在培养48小时后的生长率明显更高（图 4b）。这些染色结果表明，所有水凝胶都具有良好的生物相容性。此外，作者还使CCK-8检测法评估了水凝胶对L929 细胞的量化生物相容性。如图4c所示，O-CH和O-CH@Ag20水凝胶的细胞存活率高于对照组，表明O-CH和O-CH@Ag20水凝胶具有良好的细胞相容性。

        成纤维细胞的迁移、粘附和增殖是伤口愈合过程中的关键因素。细胞划痕试验有助于研究这些过程中细胞-细胞和细胞-基质之间的相互作用。如图4d 所示，所有组的划痕面积都大幅减少。在24小时后，O-CH组的划痕边缘之间有明显的接触（图 4e）。这项研究证实了壳聚糖水凝胶在体外增强细胞迁移的能力。图4f所示，蒸馏水与红细胞接触导致细胞肿胀和破裂释放血红蛋白，导致溶液呈红色。相比之下，O-CH、O-CH@Ag1、O-CH@Ag10和O-CH@Ag20 水凝胶的的离心溶液清澈透明。这表明这些水凝胶都不会引起溶血，均表现出良好的血液相容性。

图4：细胞相容性测试。(a) 活/死染色，(b) 相对生长率。 (c）在不同培养基中生长的成纤维细胞与水凝胶提取物共培养 24 小时后 L929 细胞的细胞活力。(d) 与水凝胶提取物共培养 6 小时、12小时和 24 小时的细胞迁移图像和迁移率。(f）水凝胶的溶血率。

        随后，作者使用金黄色葡萄球菌感染的大鼠全厚皮肤缺损模型来评估水凝胶的伤口愈合效果。图5a描述了手术过程、敷料应用和愈合时间表。如图5b所示，与纱布组和O-CH组相比，O-CH@Ag20组的细菌感染明显减少。用O-CH@Ag20水凝胶处理的伤口显示出最低水平的生物膜覆盖和炎症，表明其在预防伤口感染方面具有显著功效。伤口愈合的定量数据如图5c-e 所示。纱布组和O-CH组由于细菌感染严重，伤口愈合速度较慢。这表明 O-CH@Ag20能有效加速伤口愈合。

图5：(a) 伤口形成和治疗时间表示意图。(b)治疗后不同时间点伤口的代表性数码照片。(c) 从第 0 天到第 14 天的伤口闭合痕迹。定量分析（d）伤口面积（平方毫米）和（e）伤口闭合率。

        随后，作者对再生组织的表皮层和真皮层的形成、胶原蛋白沉积和血管化情况进行组织学分析。如图6a所示，术后第7天纱布组和O-CH组的伤口区域均有大量中性粒细胞浸润，而 O-CH@Ag20组的再生组织中仅有少量炎症细胞。这表明O-CH@Ag20水凝胶的止血和抗菌特性。如图 6b 所示，第14天，O-CH@Ag20组的胶原蛋白沉积密度最高，胶原纤维的排列也比其他组更有序。因此，最高的胶原沉积进一步证实了O-CH@Ag20纳米复合水凝胶卓越的伤口愈合性能。

图6：手术后 7 天和 14 天再生组织的组织学分析。(a) H&E和(b) Masson三色染色。

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.carbpol.2025.123500

作者：张三

审核：李全才、邵萌

编辑：郭青云

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