文章题目：Powerful Avidity with a Limited Valency for Virus-Attachment Blockers on DC-SIGN: Combining Chelation and Statistical Rebinding with Structural Plasticity of the Receptor

发表期刊：ACS Central Science

影响因子：18.728（2022）

通讯单位：Università degli Studi di Milano; Université Grenoble Alpes

        今天为大家分享一篇于2023年2月发表在ACS Central Science上的名为《Powerful Avidity with a Limited Valency for Virus-Attachment Blockers on DC-SIGN: Combining Chelation and Statistical Rebinding with Structural Plasticity of the Receptor》的文章，通讯作者是米兰大学的Anna Bernardi教授与格勒诺布尔-阿尔卑斯大学的Franck Fieschi教授。C型凝集素受体DC-SIGN是SARS-CoV-2病毒spike蛋白结合的核心受体，之前的研究证明多价的糖模拟物配体Polyman 26，可以有效的抑制DC-SIGN介导的SARS-CoV-2病毒侵染。为探究多价效应（螯合、聚集和统计学上的再结合）对配体-受体亲和力的影响（图1），作者设计了系列与Polyman 26相关的树枝状结构分子，通过一系列生物物理技术探究了其与受体的结合行为，并首次使用分子模拟技术，探究了DC-SIGN四聚体中碳水化合物识别域的灵活性对于化合物亲和力的影响。深入了解不同结合模式的作用特点后，通过较低价数的配体实现了对受体的高亲和力（nM级）。这种实验-理论相结合的多模式研究方法可以促进我们对于多价配体/多聚体蛋白受体相互作用的理解，从而为发展基于不同C型凝集素受体的新型病毒吸附阻断剂提供新思路。

图1.通过优化多价配体与寡聚受体的结合方式实现二者高亲和力。

        自然界中通常利用糖类分子的多价效应实现对其寡聚凝集素受体的高亲和力，基于此，可通过化学手段合成含有糖侧链的糖基聚合物，借助其“多价效应”模拟生命体中糖与蛋白之间的高特异性识别作用，从而广泛应用于组织工程、药物递送、生物传感器等领域。C型凝集素受体是一类借助于Ca²⁺与聚糖配体通过其上的碳水化合物识别域（CRD）进行识别、结合的受体，其中树突状细胞表面的DC-SIGN受体在人体的免疫系统中发挥了重要作用，通过与自身糖蛋白或病原表面的特异性糖配体（岩藻糖、路易斯型糖及高甘露糖等）相互作用，引发相关免疫反应。

图2. DC-SIGN受体的胞外结构。A：侧视图，CRD和颈部结构组合嵌入整个胞外区的SAXS包络中；B：四聚体头部的俯视图；C：多价结合理论的示意图；D：模拟细胞膜表面受体结合位点而设计的SPR检测模式。

        DC-SIGN受体的结构可分为胞外区、跨膜区和胞浆区三部分，胞外区结构如上图2A所示，由碳水化合物识别域和颈部（neck）铰链区组成，其中碳水化合物识别域以四聚体形式存在。为了抑制病原体结合及调节DC-SIGN引发的免疫反应，已开发了许多糖基配体以结合CRD，优化后的糖配体与受体的亲和力可达μM级，且这些配体的多价呈现可实现nM级亲和力。多价效应包括几种类型：统计学上的再结合、聚集和螯合（图2C）。在过去的20多年里，关于多价配体的构建，往往是采用相对非特异性的结合方式：优先考虑高价数配体及灵活骨架，这在很大程度上提高了统计学上的再结合作用；或者是设计多价骨架，提高同时与同一（螯合）或不同（聚集）寡聚体凝集素的结合亲和力，但灵活性有限。另一种多价性结合策略是构建较小的有限价数的配体，仔细设计其骨架以满足受体对配体连接臂长度和特性的要求。作者前期通过模块化设计，已经构建得到一个性能优良的多价结合配体Polyman 26（即化合物3.6），该结构包括一个长度可控的线性刚性“杆状”间隔臂及间隔臂连接的两个可弯曲的三价DC-SIGN配体，可以nM级亲和力高特异性结合DC-SIGN受体，从而阻断HIV病毒对DC-SIGN的侵染吸附，在体外和细胞实验中也显示了抑制DC-SIGN介导的SARS-CoV-2假病毒以及SARS-CoV-2病毒侵染的强大作用。本文中，作者以Polyman 26为基础，设计了系列糖基配体（如下图3所示），以阐述多价效应中结构对活性的影响。其中，化合物1.6、2.6和3.6均含有六价配体，但间隔臂长度不同，化合物3.1、3.2和3.2-long含有相同的刚性连接臂，但所含配体数目不同。

图3.系列糖模拟物配体的设计及其与DC-SIGN受体的亲和力比较。

        而后检测不同化合物与DC-SIGN受体的亲和力，因传统的SPR竞争实验未考虑寡聚受体表面间隙对多价结合的影响，具有一定局限性，故本研究采用DC-SIGN胞外域定向表面SPR分析方法，模拟细胞膜表面DC-SIGN受体的呈现方式，以探究实际的多价结合作用。通过测定可以看到，化合物1.6、2.6呈现类似的亲和力，表观K_D值为μM级，而化合物3.6显示出与受体nM级的亲和力，这表明刚性间隔臂的长度对于提高与DC-SIGN受体的结合亲和力至关重要（图4A）。关于配体价数对亲和力的影响，当价数从1（化合物3.1）增加到2（化合物3.2）时，亲和力增加了1个数量级，而当价数从2增加到6（化合物3.6）时，亲和力增加了2个数量级（图4B），推测螯合/聚集和统计再结合模式的累积效应是化合物3.6与受体实现高亲和力的基础。使用荧光偏振（FP）法进行DC-SIGN 胞外域四聚体滴定实验（图4C）验证了化合物3.6与受体的nM级亲和力（EC₅₀=68±8 nM）。通过沉降速度实验（图4D），证明二者的高亲和力主要是由螯合结合模式产生的。

图4.不同化合物与DC-SIGN受体的亲和力测试。A：不同连接臂长度对亲和力的影响；B：不同配体价数对亲和力的影响；C：使用荧光偏振平衡测量法进行直接结合实验；D：单独的DC-SIGN四聚体（4 μM，黑线）和不断增加化合物3.6的浓度（0.005、0.05、0.5、2、4和6 μM，从深蓝色到红色线）的沉降速度实验。

        为深入理解多价结合作用，作者对化合物1.6、2.6和3.6在DC-SIGN四聚体中可能的螯合模式进行了建模研究。在静态模型中，将DC-SIGN胞外域的各单体中Ca²⁺-Ca²⁺之间的距离分为三种类型：约40 Å的侧向距离（Side）和两个不同距离的对角线Diag1（52 Å）和Diag2（60 Å）（图5）。通过比较各单体之间的距离与配体长度，可以发现化合物1.6只能以Side模式结合受体，化合物2.6可通过Side和Diag1模式结合受体，而化合物3.6可通过以上三种螯合模式进行结合（图6）。在动态研究模型中，因DC-SIGN结构中的CRD与颈部铰链之间为灵活连接，使得DC-SIGN四聚体具有可运动性，这也解释了DC-SIGN何以识别和适应广泛病原体的侵染。动态实验证明了化合物3.6可以兼具三种结合方式，通过联合统计再结合和螯合两种模式实现与DC-SIGN受体的高效结合。值得注意的是，蛋白的聚类效应在结合过程中也发挥了一定促进作用。

图5. DC-SIGN四聚体头部各结合位点之间的距离。

图6.不同糖配体与四聚体受体之间的结合方式。A：化合物1.6以Side模式结合受体；B：化合物2.6通过Side和Diag1模式结合受体；C：化合物3.6通过三种螯合模式结合受体。

        此外，在研究SARS-CoV-2病毒对于DC-SIGN受体介导的病毒侵染过程中，存在于ACE2+内皮细胞表面的L-SIGN受体也被认为是重要的结合受体，在后续的研究中可以L-SIGN受体为结合靶点开发高亲和力的单价配体、多价数配体以及不同几何形状的连接骨架。本文中关于DC-SIGN受体的高亲和力配体筛选策略，为开发基于L-SIGN及其他C型凝集素受体的新型病毒吸附阻断剂提供了重要参考。总之，本文通过一系列生物物理技术和分子模型，探究了具有可控刚性连接臂长度和多价配体呈现的糖模拟物配体对多聚凝集素受体的不同结合模式和亲和力，化合物3.6通过联合螯合和统计学再结合两种结合模式，仅需六价配体实现了对受体的高亲和力结合（10 nM）。相比之下，针对于DC-SIGN四聚体的其他多价糖模拟物则需要16个配体才能达到类似的亲和力。

原文链接：

https://doi.org/10.1021/acscentsci.2c01136

作者：尹梦菲

审核：李全才，吕友晶

编辑：邵萌

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